【topg-sop-1205kras基因突变q-pcr标准操作规程x】一、目的

本规程旨在规范实验室对KRAS基因突变的qPCR检测流程，确保实验结果的准确性、重复性和可比性，适用于临床样本中KRAS基因突变的筛查与诊断。

二、适用范围

本规程适用于使用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测人源组织或体液样本中KRAS基因第2、3、4外显子区域的常见突变类型，如G12D、G12V、G12R、G13D等。

三、实验原理

qPCR技术基于特异性引物和探针设计，结合荧光信号监测PCR扩增过程。针对KRAS基因突变位点设计的探针可区分野生型与突变型序列，通过Ct值变化判断突变状态。

四、仪器与试剂

1. 实时荧光定量PCR仪（如Applied Biosystems 7500、Roche LightCycler等）

2. qPCR反应混合液（含Taq酶、dNTPs、缓冲液等）

3. KRAS基因突变检测试剂盒（包含特异性引物及探针）

4. 离心机、移液器、无菌PCR管等常规实验器材

五、样本处理

1. 样本类型：组织切片、血浆、血清、石蜡包埋组织等。

2. 核酸提取：采用自动化或手工方法提取DNA，确保核酸质量符合qPCR检测要求。

3. 样本保存：未使用的样本应置于-20℃或-80℃冰箱中保存，避免反复冻融。

六、实验步骤

1. 模板准备

- 将提取的DNA按照实验要求进行稀释，确保浓度在适宜范围内。

- 设置阴性对照（无模板水）、阳性对照（已知突变样本）和空白对照。

2. 反应体系配置

- 按照试剂说明书配制qPCR反应液，通常包括：

- 10 μL 2×qPCR Master Mix

- 0.5 μL 上游引物（10 μM）

- 0.5 μL 下游引物（10 μM）

- 0.5 μL 探针（10 μM）

- 8.5 μL 无菌水

- 10 μL DNA模板

3. PCR程序设置

- 预变性：95℃ 10分钟

- 循环阶段：95℃ 15秒 → 60℃ 1分钟（共40个循环）

- 结束后读取Ct值，并分析结果。

4. 数据分析

- 使用软件（如SDS 2.4）分析Ct值，判断是否为突变型。

- 若Ct值小于临界值（根据实验设定），判定为突变；反之为野生型。

七、注意事项

1. 实验过程中应严格防止污染，使用带滤芯吸头，定期清洁工作台。

2. 所有试剂应在有效期内使用，避免因降解导致结果偏差。

3. 每次实验均需包含阳性和阴性对照，确保结果可靠性。

4. 实验人员应熟悉qPCR操作流程，确保数据准确。

八、结果报告

1. 记录实验条件、样本信息、Ct值及突变状态。

2. 报告应注明检测方法、所用试剂、检测限及可能存在的假阴性/假阳性风险。

3. 如发现异常结果，应进行复测或采用其他方法验证。

九、附录

1. 常见KRAS突变位点表

2. qPCR反应体系参考表

3. 试剂储存条件说明

十、版本控制

本规程版本号为V1.0，发布日期为2025年4月。后续如有修订，将另行通知并更新版本。

注：本规程仅用于内部实验操作指导，不作为临床诊断依据。